细胞重编程前后基因组的动态稳定性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.10.023

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (10): 1621-1628.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.10.023

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细胞重编程前后基因组的动态稳定性

曹定娅，李洁亮，刘维强，何文茵，何文智，骆玉梅，范勇，孙筱放

广州医科大学附属第三医院妇产科，广东省产科重大疾病重点实验室，广东省广州市 510150

出版日期:2014-03-05 发布日期:2014-03-05
通讯作者: 孙筱放，教授，博士生导师，广州医科大学附属第三医院妇产科，广东省产科重大疾病重点实验室，广东省广州市 510150
作者简介:曹定娅，女，1979年生，湖北省黄冈市人，汉族，2013年广州医科大学毕业，硕士，医师，主要从事母胎医学研究。
基金资助:
国家自然科学基金面上项目(31171229)；国家自然科学基金委员会-广东省人民政府自然科学联合基金(U1132005)

Reprogramme-induced genomic stability

Cao Ding-ya, Li Jie-liang, Liu Wei-qiang, He Wen-yin, He Wen-zhi, Luo Yu-mei, Fan Yong, Sun Xiao-fang

Department of Gynecology and Obstetrics, Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, Key Laboratory for Major Obstetric Diseases of Guangdong Province, Guangzhou 510150, Guangdong Province, China

Online:2014-03-05 Published:2014-03-05
Contact: Sun Xiao-fang, Professor, Doctoral supervisor, Department of Gynecology and Obstetrics, Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, Key Laboratory for Major Obstetric Diseases of Guangdong Province, Guangzhou 510150, Guangdong Province, China
About author:Cao Ding-ya, Master, Physician, Department of Gynecology and Obstetrics, Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, Key Laboratory for Major Obstetric Diseases of Guangdong Province, Guangzhou 510150, Guangdong Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 31171229; the Collaborative Fund of the National Natural Science Foundation of China & the Natural Science Foundation of Guangdong Province, No. U1132005

摘要/Abstract

摘要：

背景：研究表明，人类早代诱导多能性干细胞发生拷贝数变异多于晚代、体细胞及人类胚胎干细胞。
目的：分析重编程过程是否危及基因组稳定性，进一步探讨诱导多能性干细胞建系的有效性。
方法：利用高分辨率的Affymetrix Cytoscan HD芯片检测遗传性癫痫先证者的体细胞及早代诱导多能性干细胞，分析重编程后基因组拷贝数变异及杂合性缺失的变化。
结果与结论：与遗传性癫痫患者体细胞相比，其早代诱导多能性干细胞的杂合性缺失未发现明显差异，而存在更多的拷贝数变异，且均为微重复，涉及致癌基因。结果证明重编程过程中基因组稳定性动态变化，需要动态监测诱导多能性干细胞保证其基因组稳定性及临床安全性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

全文链接：

关键词: 干细胞, 诱导, 诱导多能性干细胞, 重编程, 拷贝数变异, 杂合性缺失, 遗传性癫痫, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Some studies have shown that more copy number variations are present in early passage human induced pluripotent stem cells than later passage human human induced pluripotent stem cells, their parental somatic fibroblasts or human embryonic stem cells.
OBJECTIVE: To investigate whether the reprogramming process itself compromises genomic stability and further explore the efficiency of induced pluripotent stem cell establishment.
METHODS: Using high-resolution Affymetrix CytoScan HD array, we compared copy number variations and loss of heterozygosity in early passage induced pluripotent stem cells with their fibroblast cell origins from genetic epilepsy patients.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with somatic fibroblasts from genetic epilepsy patient, there was no difference in the loss of heterozygosity between the two types of cells, but more copy number variations were present in early passage human induced pluripotent stem cells which were characterized as microduplication and involved oncogenic genes. Results demonstrate the dynamic nature of genomic abnormalities during reprogramming process and the necessity of frequent monitoring human induced pluripotent stem cells to assure their genomic stability and clinical safety.

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Key words: induced pluripotent stem cells, DNA copy number variations, genomics, loss of heterozygosity, epilepsy

中图分类号:

R394.2

曹定娅，李洁亮，刘维强，何文茵，何文智，骆玉梅，范勇，孙筱放. 细胞重编程前后基因组的动态稳定性[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(10): 1621-1628.

Cao Ding-ya, Li Jie-liang, Liu Wei-qiang, He Wen-yin, He Wen-zhi, Luo Yu-mei, Fan Yong, Sun Xiao-fang. Reprogramme-induced genomic stability[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(10): 1621-1628.

图/表（结果） 11

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引言

诱导多能性干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)是通过插入特定基因诱导体细胞重编程得到的多能干细胞，与胚胎干细胞具有类似的生物学特性^[1] 。2006年日本京都大学Shinya Yamanaka 率先把Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4这4种转录因子引入小鼠胚胎或人皮肤成纤维细胞，发现可诱导其发生重编程产生诱导多能性干细胞^[2] 。人类诱导多能性干细胞具有自我更新、无限增殖及多向分化的能力，可以作为研究及治疗应用的有效资源，但致瘤性、致畸性及遗传与表观遗传的不稳定性是干细胞应用于临床的瓶颈^[3] 。自从第一株胚胎干细胞系建立以来，干细胞基因组结构变异的研究一直被科学家所关注^[4-5] 。几乎在每种多能性干细胞中，均会涉及到染色体异常、CTG动态重复、杂合性缺失(loss of heterozygosity, LOH)及点突变等^[6-14] 。近年来，还有报道人类诱导多能性干细胞存在很多拷贝数变异(copy number variations，CNVs) ^[15-16] ，这些拷贝数变异可能是体细胞来源的或重编程本身产生，即诱导多能性干细胞特异性的；并且重编程过程与抑癌基因缺失有关，而长期培养则与致癌基因重复紧密相关。2011年Laurent等^[17]亦发现人类胚胎干细胞及人类诱导多能性干细胞存在大量拷贝数变异，且多能干细胞的许多缺失或重复容易产生在增加致癌风险的基因组区域。Taapken等^[14]发现无论是利用病毒插入还是游离型载体(episomal)的重编程方法，与人类诱导多能性干细胞基因组失衡无明显关系，而重编程过程和/或早期适应性与人诱导多能性干细胞基因组失衡密切有关。2010年 Hussein等[18]在《Nature》上报道，早代诱导多能性干细胞存在的拷贝数变异多于晚代、相应体细胞及人类胚胎干细胞。同年，Martins-Taylor等^[15]报道大于25%的人类诱导多能性干细胞发现1q31.3及17q21.1区域存在拷贝数变异，并且在12%的人类诱导多能性干细胞发现8q24.3区域存在特异性的微缺失。
许多分析方法都能用于诱导多能性干细胞基因组稳定性(如拷贝数变异)的检测，例如染色体显带技术、荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH)、荧光定量 PCR (quantitative fluorescence polymerase chain reaction, QF-PCR)等，这些方法分辨率或通量低，限制了大规模使用。近年来Mayshar等[19]利用基因组表达谱芯片检测人类诱导多能性干细胞基因组有无异常，但是表达谱芯片的分辨率为10 Mb以上，且无法特异性地检出关于干细胞多能性方面的基因组异常。随着全基因组克隆资源与人类基因组测序结果的整合，高通量芯片平台的建立以及数据分析系统的优化，新型强大的细胞遗传分析平台——比较基因组杂交技术(array-based comparative genomic hybridization，aCGH)可准确而快速发掘和诊断拷贝数变异。目前，利用基因组芯片(aCGH及SNP array)可以高分辨率地检测出拷贝数变异、嵌合体及杂合性缺失等基因组结构变异^[20-22] 。本实验拟利用Affymetrix高分辨率CytoScan HD芯片对1例遗传性癫痫患者的皮肤成纤维细胞及相应的早代诱导多能性干细胞(P12)进行检测，观察重编程前后基因组拷贝数变异及杂合性缺失的改变，了解拷贝数变异发生区域涉及的相关基因，进一步探讨诱导多能性干细胞建系的有效性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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材料方法

设计：细胞学，体外观察实验。

时间及地点：2012年9月至2013年4月在广州医科大学附属第三医院妇产科实验部完成。

材料：

实验对象：遗传性癫痫患者，男，8岁，与其父亲具有相同的SCN1A基因突变，半岁时发病至今，外周血染色体检查核型正常。获得其父母的知情同意及伦理委员会批准，取其皮肤原代培养成纤维细胞并利用反转录病毒重编程为诱导多能性干细胞。实验样本为成纤维细胞及相应诱导多能性干细胞(P12)。

实验方法：

诱导多能性干细胞的获取：包装Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4 4个因子的反转录病毒感染患者成纤维细胞，感染后12 h换液，hrGFP病毒质粒作为对照感染体细胞，观察感染效率。4 d后胰酶消化接种到饲养层细胞上，改为诱导多能性干细胞培养基。每日观察细胞，隔天换液，培养15-25 d观察到边界清晰、核仁明显的呈克隆样生长的细胞群落，即为诱导多能性干细胞克隆。当克隆较大时机械挑取进行传代。传代后见克隆样生长细胞，细胞排列紧密，成团、成簇生长，高倍镜下观察不易分辨单个细胞，在饲养层细胞存在的条件下可以保持稳定状态。四五天传代1次，可以稳定传代。于第8代时进行干细胞多能性鉴定、体外分化能力检测、个体识别及核型分析。

基因组DNA的提取：采用Qiagen试剂盒。将PBS洗涤过的2×10⁶细胞加入200 µL PBS重悬混匀液各放入新的Ep管，做好标记，加入20 µL蛋白酶K、4 µL RNA酶，振荡混匀后室温放置30 min。继续加入200 µL裂解液AL，振荡混匀后短暂离心，56 ℃水浴30 min。短暂离心后加入200 µL无水乙醇。振荡混匀后加入离心柱，离心6 000×g 1 min。换新的收集管，离心柱加入500 µL AW1，离心6 000×g 1 min。换新的收集管，离心柱加入500 µL AW2，最大速离心3 min。换新的收集管，空柱离心最大速 1 min。将离心柱放入新的Ep管，加入预热的AE 30-50 µL，静置3 min后离心6 000×g 1 min。Ep管中的液体即为DNA液，-20 ℃长期保存。取1.5 µL DNA用紫外分光光度仪测量A₂₆₀和A₂₈₀值，判断DNA的浓度及纯度。若A₂₆₀/A₂₈₀值> 1.8时，说明DNA纯度高，否则需要进行DNA纯化。

基因组DNA的纯化及质控：适量DNA中加入0.5倍体积低温(0.01 mol/L)醋酸铵、前两者2.5倍体积的低温无水乙醇，振荡混匀后置于-20 ℃ 60 min。最大速离心20 min，弃上清。-20 ℃保存的体积分数为80%乙醇 100 µL加入沉淀中，混匀后离心5 min(12 000 r/min)。再次将-20 ℃保存的体积分数为80%乙醇 100 µL加入沉淀中，混匀后离心 5 min(12 000 r/min)。AE溶解沉淀，振荡混匀。紫外分光光度仪NanoDrop 2000测量DNA浓度(A₂₆₀/A₂₈₀值宜为1.85-1.95，A₂₆₀/A₂₃₀值2.10-2.20)。电泳观察基因组DNA大小、有无降解。

Affymetrix CytoScan HD芯片操作流程(http://www.affymetrix.com)：质控良好的基因组DNA经过酶切、连接、PCR、PCR产物纯化、片段化、标记后，若每次质控通过，则上样于芯片50 ℃ 60 r/min杂交16-18 h，最后在Affymetrix洗染系统进行洗涤、染色和扫描。

芯片结果分析：使用软件Chromosome Analysis Suite(CHAS) 2.0软件系统对两个样本的扫描结果进行分析，借助OMIM、DGV、DECIPHER、ISCA、Pubmed等数据库进行综合分析。

主要观察指标：芯片分析后观察早代诱导多能性干细胞与成纤维细胞在拷贝数变异、杂合性缺失方面的区别，了解有无涉及多能性基因、致癌基因等。

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讨论

文献[19]报道，诱导多能性干细胞基因组失衡来源于3个方面：①体细胞^[23] 。体细胞的种类及其年龄对基因组稳定性均有影响，体细胞来源的患者年龄越大，相应诱导多能性干细胞的拷贝数变异、杂合性缺失越多。②重编程的选择性。重编程的效率越高，则产生的非整倍体越少；一些重编程的外源因子和小分子也可使重编程后基因组不稳定。重编程及人类诱导多能性干细胞建系过程中快速选择性产生某些非整倍体。③培养适应性。培养时间、技术以及环境可以改变细胞循环，导致生殖细胞肿瘤生成等^[24] 。长期培养可发生12号染色体或12号染色体短臂重复，涉及多能性基因NANOG及GDF3过表达，与细胞循环有关。Hanna等^[25]指出细胞分裂率是重编程有效成功的关键参数。
本实验利用Affymetrix Cytoscan HD芯片发现患者来源的早代诱导多能性干细胞存在拷贝数变异及杂合性缺失，无嵌合体，且G显带染色分析核型为46，XY。患者诱导多能性干细胞的拷贝数变异与其体细胞拷贝数变异比较，重编程后产生更多与细胞循环、凋亡及肿瘤有关的基因(表2)，未发现文献[15，26]报道的1q31.3、17q21.1、8q24.3、20q11.21区域的拷贝数变异，未发生微缺失，均为微重复。但是，诱导多能性干细胞较其体细胞少了1p36.32、16p11.2及20q13.33区域的拷贝数变异，因为这些位于端粒或着丝粒附近的区域芯片探针较少，所以计算分析得出假阳性结果，其log2 Ratio峰值不明显。而在2q21.1、20q11.21等区域的拷贝数变异形成的log2 Ratio峰值明显，为阳性结果。
由表2可以看出，2q33.3区域涉及的CREB1基因编码DNA结合蛋白的亮氨酸拉链家族转录因子，5q35.1区域涉及的ATP6V0E1基因编码V-ATP酶复合物，两者对细胞循环具有重要作用。15q13.3区域涉及的GREM1、FMN1基因编码BMP(骨形成蛋白)对手家族，在调节器官生成、躯体成形及组织分化方面起作用。20p13区域涉及的CDC25B激活细胞周期蛋白依赖性激酶，为有丝分裂所必需；使细胞循环M期和G1期的核蛋白在S期和G2期进入细胞质。CDC25B具有致癌性。20q11.21区域涉及的ID1及BCL2L1编码抗凋亡蛋白BCL-X；这种现象在人类胚胎干细胞长期培养中可以发生^[20,22] 。
Laurent等^[17]报道人类诱导多能性干细胞早代产生涉及肿瘤抑制基因的缺失型拷贝数变异，长期培养则产生涉及癌基因的重复型拷贝数变异。而本研究的早代诱导多能性干细胞未产生缺失型拷贝数变异, 且涉及以前未于干细胞中发现的CDC25B基因。Hussein将诱导多能性干细胞早代发生的拷贝数变异分为3类：①仅发生于早代的同源缺失。②仅发生于晚代的同源缺失。③长期存在的同源缺失。早代拷贝数变异多发于基因组的脆性区，比相应体细胞及人类胚胎干细胞常见，导致大量拷贝数变异缺失产生于重编程或早期培养。本实验发现体细胞也存在拷贝数变异，因为本实验患者是遗传性癫痫，亦可产生很多症状性拷贝数变异^[27-28] 。而最近报道，诱导多能性干细胞的新发拷贝数变异可能是因为体细胞嵌合体经重编程后优势增长而形成的^[29-30] ，这对干细胞在研究及临床应用方面极具挑战性。
图4所示在分辨率大于3 Mb的情况下，早代诱导多能性干细胞与相应体细胞的杂合性缺失无差别。本实验利用高分辨率的Affymetrix CytoScan HD芯片分析了样本基因组的拷贝数变异及杂合性缺失，因其具有195万拷贝数变异探针及75万单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism，SNP)探针，可以快速高分辨率地检测出拷贝数变异及杂合性缺失，而先前文献报道的一般使用Affymetrix SNP 6.0或Agilent芯片检测^[13,31] ，适用于全基因组关联分析(genome-wide association study, GWAS)研究，可以产生很多假阳性结果。
随着生物技术日新月异的进步，新一代测序技术已广泛应用于医学生物领域，在干细胞研究方面，因其具有高敏感、高分辨率地检测单个碱基而逐渐用于监测干细胞基因组稳定性[32]。本实验检测早代诱导多能性干细胞及相应体细胞发现其拷贝数变异有改变，涉及细胞循环、凋亡及肿瘤相关的基因，应继续严密检测其染色体及基因组有无改变，稳定环境长期培养后观察其基因组稳定性，争取为临床及科研提供安全、高效、遗传及表观遗传稳定的诱导多能性干细胞。

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